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Theses Year : 2022

Identification and modification of amine dehydrogenases by genomic and structural approaches for biocatalytic amine synthesis

Identification et modification d'amine déshydrogénases par approches génomique et structurale pour la synthèse biocatalysée d'amines

Laurine Ducrot
  • Function : Author
  • PersonId : 1235946
  • IdRef : 268367930


Facing the great demand of amine intermediates in pharmaceutical, agrochemical as well as in fine and bulk chemical industries, new sustainable processes for amine synthesis need to be developed considering the current economic and environmental challenges. Biocatalysis, i.e. the use of enzymes in synthesis, represents a greener alternative to traditional chemical processes. It enables to work catalytically in mild conditions and generally with shorter reaction times thanks to the high chemo- and stereoselectivity of enzymes. First mainly limited to lipases and transaminases, the biocatalytic alternatives for amine synthesis have expanded since the 2010s with the discovery of enzymes catalyzing the reductive amination of carbonyl-containing compounds. These solutions encompass several enzyme families such as opine dehydrogenases, imine reductases, reductive aminases (RedAms) and amine dehydrogenases (AmDHs). The latter, previously restricted to engineered amino acid dehydrogenases, has grown in recent years thanks to the identification of genes coding for native AmDHs (nat-AmDHs) that catalyze the imine formation from a carbonyl compound and ammonia and its subsequent reduction by NAD(P)H cofactor. These enzymes harbor a high (S)-enantioselectivity rarely obtained from other enzyme families catalyzing the same reaction. The nat-AmDH family has been extended over the years through several iterations of (meta)genome mining but still lacked in active site diversity. The studies described in this research work aimed at filling this missing diversity using structure-guided approaches based on homology models or 3D structures obtained from an external collaborative work. First, a deep structural analysis of the family members coupled with targeted protein engineering highlighted the importance of some residues in the active site. The family was furthered characterized for reductive amination of still undescribed key substrates such as short (hydroxy)ketones or aromatic aldehydes. Some approaches were carried out to expand the substrate scope of the native AmDHs, restricted to short carbonyl substrates. One strategy relied on the in silico identification of two bulky residues highly conserved within the family which were considered as hot spots for the active site expansion. These two residues were mutated in ten nat-AmDHs bearing similar scaffolds but slightly different active sites. The majority of the mutants were active towards still unreached substrates such as aldehydes from hexanal (non-optimized conversions up to 99.5%) to nonanal (44.5%), ketones from hexan-2-one (39.5%) to nonan-2-one (16%) and 4-phenylbutan-2-one (52.5%) while still retaining their high (S)-enantioselectivity (>90% ee). The best hit CfusAmDH-W145A was furthered characterized and used in a 100-mg scale synthesis of (2S)-octan-2-amine and heptan-1-amine. Secondly, an approach of continuous in vivo evolution using automated devices available at the Genoscope was attempted to enhance the activity of some nat-AmDHs and AspRedAm. The selection screens were based on the activity of these enzymes in the oxidative deamination way that was hypothetically too low to enable sufficient initial cells growth thus preventing good starting point for evolution. Eventually, within the scope of the MODAMDH project to find AmDHs with high sequence diversity among 2.6 billions sequences, the family was drastically extended from 2,011 members to 17,039 members. Thus, taking advantage of all the structural and experimental data collected on the characterized nat-AmDHs, a promising structure-guided selection of 92 new enzymes harboring specific features has been done. Thanks to this work, we have a nearly complete structural picture and understanding of the nat-AmDHs diversity that will help further improvements and applications in synthetic chemistry.
Pour faire face à la forte demande en amines des industries pharmaceutiques, agrochimiques et plus généralement des industries de chimie fine et de gros tonnages, de nouveaux procédés durables de synthèse d'amines doivent être développés en prenant en compte les challenges économiques et environnementaux actuels. La biocatalyse, qui consiste en l'utilisation d'enzymes pour la synthèse, représente une alternative plus verte aux procédés chimiques conventionnels. Elle permet de travailler de manière catalytique dans des conditions douces et généralement dans des temps réactionnels plus court grâce à la chimio et stereosélectivité des enzymes. D'abord centrées autour des lipases et des transaminases, les solutions biocatalytiques pour la synthèse d'amines se sont étendues dans les années 2010 avec la découverte d'enzymes catalysant l'amination réductrice de composés carbonylés. Ces solutions comprennent plusieurs familles telles que les opine déshydrogénases, les imine réductases, les réductive aminases (RedAms) et les amine déshydrogénases (AmDHs). Ces dernières étaient restreintes aux acide aminé déshydrogénases ingénierées jusqu'à la découverte d'enzymes natives (nat-AmDHs) catalysant la formation de l'imine en présence d'ammoniac et sa réduction par un cofacteur NAD(P)H. Elles favorisent la formation de l'amine (S), rarement décrit dans d'autres familles d'enzymes catalysant la même réaction. La famille des nat-AmDHs s'est étendue grâce à plusieurs cycles d'exploration de (méta)génomes mais manquait encore de diversité de séquences. Les recherches présentées cherchent à apporter cette diversité manquante par des approches basées sur des analyses in silico de modèles par homologie ou structures crystallographiques, obtenues grâce à un travail collaboratif extérieur. Une analyse structurale poussée de la famille couplée à un travail d'ingénierie protéique a révélé l'importance de certains résidus du site actif. La caractérisation de quelques nat-AmDHs a montré leur activité sur des substrats encore peu étudiés tels que des petits aldéhydes aromatiques ou cétones hydroxylées. Plusieurs approches ont été utilisées pour étendre le spectre de substrats des nat-AmDHs restreints aux petits composés carbonylés ( 90% ee). Le meilleur mutant CfusAmDH-W145A a été utilisé pour la synthèse d'environ 100mg de (2S)-octan-2-amine et heptan-1-amine. Une autre approche d'évolution in vivo en continu, utilisant les automates de culture du Genoscope, a été tentée pour l'amélioration des activités de certaines nat-AmDHs et d'AspRedAm. Les deux sélections se basaient sur l'activité de déamination oxidative de ces enzymes qui s'est révélé hypothétiquement trop faible pour permettre une croissance cellulaire suffisante pour permettre une évolution. Dans le cadre du projet MODAMDH cherchant à trouver plus de diversité de séquences AmDH, la famille a été drastiquement étendue de 2011 à 17039 membres. En se basant sur les analyses structurales et résultats expérimentaux obtenus, une sélection de 92 enzymes possédant des caractéristiques particulières a été faite. Grâce à ce travail, nous avons une vue et une compréhension quasi complètes de la diversité des nat-AmDHs ce qui aidera à leur amélioration et à leur application en synthèse.
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Laurine Ducrot. Identification and modification of amine dehydrogenases by genomic and structural approaches for biocatalytic amine synthesis. Catalysis. Université Paris-Saclay, 2022. English. ⟨NNT : 2022UPASF079⟩. ⟨tel-04023477⟩
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